中科检测是独立第三方检测机构，具备开展病毒杀灭试验的生物安全等级2级（P2）实验室，可开展消毒器械、消毒剂、抗菌材料等产品的病毒灭活验证试验，欢迎预约参观实验室。
本文详细介绍了新冠病毒灭活试验的具体方法和步骤。

 
新冠病毒灭活试验：试验器材
1、试验病毒与细胞
试验病毒为分装保存并确定病毒滴度的新型冠状病毒培养物，细胞株为非洲绿猴肾传代细胞（VeroE6）或其它适合用于新型冠状病毒增殖培养的细胞系。
2、有机干扰物
牛血清白蛋白。
3、试剂
消毒因子、中和剂、细胞消化液、细胞维持液和细胞培养液等。
4、仪器
二氧化碳培养箱、倒置显微镜、冰箱、水浴箱、II 级或 II 级以上生物安全柜等。
5、耗材
无菌带滤芯tip头、吸管、离心管、冻存管、试管、多孔细胞培养板、单道移液器、多道移液器等。
6、载体
可选用布片、玻璃片、不锈钢片等。
 
新冠病毒灭活试验：细胞准备
实验所用Vero- E6细胞或其它细胞在细胞培养室常规传代培养，置二氧化碳培养箱（36 ℃±1 ℃，5%±1% 二氧化碳）中培养至单层细胞备用。
 
新冠病毒灭活试验：病毒悬液的制备
取出-80 ℃低温保存的新型冠状病毒，室温解冻后，与设定浓度的有机干扰物混合作为消毒剂灭活试验用病毒悬液。
 
新冠病毒灭活试验：载体的制备
1、载体应根据消毒对象选择相应的材料。常用的材料有布片、玻璃片、不锈钢片等，金属载体一般用 12 mm 直径圆形金属片（厚 0.5 mm），其他材质载体一般为方形，大小 10 mm×10 mm，特定用途的消毒因子可使用其他相兼容材质的载体。
2、所用载体于染病毒前，应进行脱脂处理。脱脂过程应严格按照如下步骤进行：
a) 将载体放入含洗涤剂的水中煮沸 30 min;
b) 用自来水漂洗；
c) 用蒸馏水煮沸 10 min；
d) 用蒸馏水漂洗至 pH 呈中性；
e) 晾干，备用。
3、载体经压力蒸汽灭菌后烘干备用，试验前使用滴染法染病毒悬液。
4、滴染载体的病毒滴度对数值应≥4.0。
 
新冠病毒灭活试验：中和剂鉴定试验
鉴定试验旨在确定所选中和剂是否适用于拟进行的细胞感染法病毒灭活试验。中和剂鉴定试验包括预试验和正式试验，通过预试验确定消毒剂、中和产物和中和剂等对细胞生长有无影响；通过所设各组试验结果综合分析，确定所用中和剂是否对测试消毒剂有良好的中和作用，对试验用病毒和细胞株是否有害或不良影响；中和试验用消毒剂浓度应为正式消毒试验最高浓度，作用时间最短不得少于30 s。试验重复3次。
 
新冠病毒灭活试验：试验步骤
新冠病毒灭活试验原理，是用细胞感染法测定消毒因子作用前后（或对照组与实验组）样本中病毒的量。以细胞病变作为判断指标，确定各组病毒的感染滴度，观察消毒因子对新型冠状病毒的灭活效果。
1、悬液法病毒灭活试验
a) 取待测消毒剂，用灭菌硬水稀释至所需浓度的 1.25 倍，于 20 ℃±1 ℃水浴中备用。
b) 病毒悬液的制备：取出-80 ℃低温保存的新型冠状病毒，室温解冻后，与有机干扰物按照 1:1 比例混合作为消毒剂灭活试验用病毒悬液。
c) 消毒试验：取上述病毒悬液1份加入4份待检消毒剂，立即混匀并记时。作用至规定时间，立即取出 0.1 mL，加入经鉴定合格的 0.9 mL 中和剂中混匀；或用经鉴定合格的除药方法处理。
d) 对照组试验：阳性对照组为病毒对照组，观察病毒生长是否良好，病毒滴度是否达到试验要求；阴性对照组用细胞维持液作为阴性对照，观察有无污染，细胞生长是否良好。
e) 以上各组按照终点稀释法分别进行病毒滴度测定。试验重复 3 次。
f) 终点稀释法：用细胞维持液对待滴定样本做 10 倍系列稀释，吸取样液 100 μL，接种于单层细胞培养板上，每个滴度接种 4 孔。在 36 ℃±1 ℃放置 1 h～2 h 后，取出培养板，更换细胞维持液。继续放入二氧化碳培养箱中（36 ℃±1 ℃,5%±1% 二氧化碳）培养 3-4 天，显微镜下观察细胞生长状态，记录细胞病变情况。
2、载体法病毒灭活试验
a) 取待测消毒剂，置于 20 ℃±1 ℃水浴中备用。
b) 病毒载体的制备：取灭菌载体片，滴染新型冠状病毒晾干备用。
c) 消毒试验：取病毒载体置于消毒因子，作用至规定的时间后取出放入经鉴定合格的中和剂或洗脱液 1.0 mL 中，作用 10 min,混匀洗脱。消毒器械载体布点应置于最难杀灭部位，具体方法参照《消毒技术规范》。
d) 对照组试验：阳性对照组为病毒对照组，观察病毒生长是否良好，病毒滴度是否达到试验要求；阴性对照组用细胞维持液作为阴性对照，观察有无污染，细胞生长是否良好。
e) 以上各组按照终点稀释法分别进行病毒滴度测定。试验重复 3 次。
f) 终点稀释法：用细胞维持液对待滴定样本做 10 倍系列稀释，吸取样液 100 μL，接种于单层细胞培养板上，每个滴度接种 4 孔。在 36 ℃±1 ℃放置 1 h～2 h 后，取出培养板，更换细胞维持液。继续二氧化碳培养箱中（36 ℃±1 ℃,5%±1% 二氧化碳）培养 3-4 天，显微镜下观察细胞生长状态，记录细胞病变情况。
 
新冠病毒灭活试验：结果评价
同时符合下列a)和b)的消毒因子判为消毒效果合格：
a) 去除残留消毒剂效果的中和剂鉴定试验合格；
b) 悬液灭活试验，每次试验对新型冠状病毒应有效灭活，阳性对照组病毒滴度对数值应≥5.0或载体灭活试验，每次试验对新型冠状病毒应有效灭活，阳性对照组病毒滴度对数值应≥4.0。
 
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