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2021-10-08
病毒是可引发疾病的微生物，比细菌小，由蛋白质外壳、包膜和含有DNA或RNA的内核构成，病毒依靠活细胞实现自我复制。而宣称能消毒的各式空气净化器、消毒器械、消毒剂及具有抗病毒功效的口罩、纺织品等产品或材料，是否能够达标消毒或抗毒的标准，无一不需要经过病毒灭活试验。本文特此探讨中科检测实验室是如何进行病毒灭活试验的。
病毒灭活试验的适用范围
主要适用于消毒产品鉴定或日常监测。用具有一定代表性的、活的病毒及其细胞感染技术，评价各种用途的消毒因子对测试病毒的杀灭效果。按此方法进行的试验，只是对消毒因子的灭活病毒能力的重要方面进行验证。
病毒灭活试验的试验器材
(1)试验用病毒株：脊髓灰质炎病毒1型(poliovirus-Ⅰ ,PV-Ⅰ)疫苗株；艾滋病病毒Ⅰ型(HIV-1)美国株。
(2)宿主细胞：可采用VERO细胞系、BGM细胞、Hela细胞系或FL细胞系，作为PV-1的测试细胞。用含有人T淋巴细胞白血病病毒Ⅰ型( human T cell leukemiavirus 1，HTLV-1)基因的人淋巴细胞(MT4株)作为HIV-1的测试细胞。
(3)细胞培养瓶与96孔培养板。(4)恒温水浴箱。
(5)二氧化碳培养箱。
(6)层流超净工作台。
(7)低温冰箱(-20℃，-80℃)。
(8)液蚕罐。
(9)倒置显微镜。
(10)离心机。
(11)可调移液器及配套一次性塑料吸头。
(12)细胞维持培养基。
(13)细胞完全培养基。
(14)去离子水。
病毒灭活试验的病毒悬液制备
(1)从液氮中取出冻存的试验用宿主细胞，在37℃温水中迅速融化，用毛细吸管移植于含有细胞维持液的细胞管内，吹吸数次，使混匀，立即离心(3000r/min，3min)，去上清液。再加入适当的细胞维持液，吹吸数次，使混匀，同上离心后，转种于加有10ml完全培养基的培养瓶中。逐日观察细胞生长情况，在细胞长满单层时，用于消毒试验。
(2）取出低温冻存的试验病毒毒种，37℃水浴融化，用细胞维持液作10倍稀释，然后接种于已经长满单层细胞的细胞瓶内，置37℃温箱中，使与细胞吸附、生长。逐日观察病变，待3/4细胞出现病变时，收获病毒。
(3）将含有病毒及宿主细胞的培养液，在冰浴条件下，用超声波（或反复冻融）破碎宿主细胞，释放病毒。然后，尽快离心(6000r/min，15min）去除沉淀（主要为细胞碎片)，上清液即为所需的病毒悬液。按每管1.Oml分装于无菌离心管(1.5ml)中-
(4)取1支病毒悬液，按病毒滴度测定法，测定其病毒滴度。其余均冷冻保存于-80℃备用。
病毒灭活试验的滴度计算方法
(1)终点稀释法病毒感染滴度的计算
以半数细胞感染剂量(TCID50)表示。TCID50的对数值计算公式如下。
TCID50对数值=病变率高于50%组稀释度的对数值＋距离比例
(2)噬斑法病毒感染滴度的计算
噬斑法病毒感染滴度，以噬斑形成单位数（ pfu)，简称噬斑数表示。计数方法同活菌培养计数技术。
每毫升测试样品中的病毒含量计算（pfu/ml）=平板平均噬斑数×稀释倍数
(3)平均灭活对数值的计算
平均灭活对数值按下式计算：设阳性（病毒）对照组平均病毒感染滴度（TCID50或pfu）的为No，试验（消毒)组平均病毒感染滴度（TCI,50或pfu）为Nx。
平均灭活对数值= log No—log Nx
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